Ultrastrukturelles Tagging von Ionenkanälen in Nervenzellen

Das Hauptziel dieses Projekts ist es, neue chemische Tagging Methoden für die quantitative Elektronenmikroskopie zu entwickeln, die es uns ermöglichen, absolute Zahlen an Ionenkanälen und deren Untereinheiten Zusammensetzung in neuronalen Zellen im Gehirn zu erhalten. In den letzten zehn Jahren eröffneten grün-fluoreszierende Proteine und deren Derivate neue Dimensionen in der Visualisierung von Biomolekülen auf lichtmikroskopischer Ebene. Es existieren jedoch äußerst wenige solcher Tag`s für die Elektronenmikroskopie (EM) und keines von ihnen besitzt eine eins-zu-eins Auflösung um in-situ jedes einzelne Molekül darzustellen. Um zu verstehen wie Nervenzellen zur Informationsverarbeitung im Gehirn chemische und elektrische Impulse empfangen und integrieren, ist die präzise Lokalisierung und Quantifizierung verschiedenster Ionenkanäle und deren Untereinheiten Zusammensetzung in der neuronalen Plasmamembran jedoch essentiell. In diesem Projekt werden wir Markierungsmethoden mit ultrakleinen Metallpartikeln (Durchmesser 1-2 nm) an Gefrierbruch-Replikas im Labor von Prof. Shigemoto und reaktive Tag-Systeme im Labor von Prof. Ojida kombinieren, um eine neue EM Tag-Methode zur Etablierung absoluter Zahlen an Ionenkanal-Untereinheiten zu entwickeln. Neue chemo-synthetische Proben, die an spezifische Tag-Sequenzen binden, werden auf spezifische Untereinheiten verschiedener Ionenkanäle wie spannungsabhängige Kalium- und Calcium-Kanäle im zerebralen Cortex von Mäusen exprimiert durch in-utero Elektroporation und knock-in Technologien gerichtet. Diese synthetischen Proben werden mittels 1-2 nm ultrakleinen Gold- und Palladium Partikeln auf der EM-Ebene sowie Fluoreszenzfarbstoffen auf der LM-Ebene visualisiert, um die Verteilung und die Zahl der verschiedenen Ionenkanaluntereinheiten in bestimmten Membrankompartimenten der cortikalen Pyramidenzellen zu identifizieren. Die ultrakleinen Gold- und Palladium Partikel können durch 200kV Raster-Transmissionselektronenmikroskopie detektiert und durch hochsensible Energie- Röntgen- Spektrometrie (EDS) differenziert werden. Die Partikel- Markierungen werden mit elektrophysiologischen Messungen von Ionenkanal Zahlen kalibriert, um eine eins-zu- eins Nachweisempfindlichkeit der Methode zu gewähren. Diese Methode wird eingesetzt, um die exakten Zahlen an spannungsaktivierten Kalium- und Calcium-Kanälen sowie deren Untereinheiten Zusammensetzung auf Einzelkanal-Ebene in dendritischen und axonalen Plasmamembranen zu etablieren. Die Ergebnisse werden grundlegende Informationen zur Analyse der Integration chemischer und elektrischer Signale in Neuronen und deren Simulation für das Verständnis neuronaler Berechnungskapazitäten im Gehirn liefern. Die neu entwickelten EM-Tag Methoden werden voraussichtlich auch sehr nützlich für eine breitere biologische Anwendung zur Visualisierung und Quantifizierung verschiedenster anderer Membranproteine sein.

Das Hauptziel dieses Projekts ist die Entwicklung neuer chemischer Markierungsmethoden für die quantitative Elektronenmikroskopie. Diese sollen es uns ermöglichen, die absolute Zahl an Ionenkanälen und Rezeptoren auf Neuronen zu messen. Das liefert uns grundlegende Information für das Verständnis der neuronalen Berechnung im Gehirn. Im letzten Jahrzehnt eröffneten das Grüne Fluoreszierende Protein und dessen Derivate neue Felder in der Visualisierung von Biomolekülen in der Lichtmikroskopie. Allerdings gibt es für die Elektronenmikroskopie kaum vergleichbare Marker, und keines der verfügbaren erlaubt es, alle einzelnen Moleküle in situ mit einer eins-zu-eins Auflösung zu visualisieren. Wir verbinden Methoden der Gefrierbruch-Replika Markierung, die im Shigemoto Labor entwickelt wurden, mit reaktiven Markierungssystemen aus dem Ojida Labor, um eine neue Markierungsmethode für EM zu entwickeln. Neue synthetische chemische Proben, die an bestimmte Markierungssequenzen binden, wurden erstmals für den in HEK Zellen exprimierten Kaliumkanal und den Bradykinin-Rezeptor angewendet. Die chemischen Proben wurden auf der EM Ebene mit 1-2nm ultrakleiner Gold und Silber Verstärkung visualisiert. Die Ergebnisse zeigten eine hohe Empfindlichkeit der Methode im Vergleich zur konventionellen Immunmarkierung für das Grüne Fluoreszierende Protein. Die Methode wird für neuronale Membranen angewandt werden. Es wird erwartet, dass sie sich als sehr nützlich für breitere biologische Anwendungen der Visualisierung und Quantifizierung anderer Membran-Protein Komplexe erweist.