Evolution von Metallothioneinen bei Gastropoden

Ziel des vorliegenden Projektantrages ist es, die Evolution der Metallothioneine (MTs) bei Gastropoden nachzuvollziehen und zu verstehen, wobei die strukturelle und funktionelle Differenzierung dieser Proteinfamilie von unspezifischen Peptiden hin zu Metall-spezifischen Isoformen untersucht werden soll. Insbesondere möchten wir verstehen lernen, welche strukturelle Anpassungen notwendig waren, um diese Spezifität zu erzielen, in welchen Zeiträumen dieser evolutionäre Differenzierungsprozess erfolgte, und wie sich strukturelle Modifikationen auf die Metall-spezifische physiologische Funktion dieser Proteine auswirken. Um unser Ziel zu erreichen, planen wir einen multidisziplinären und methodisch vielfältigen Ansatz: So möchten wir erstens mit Hilfe molekularer und phylogenetischer Methoden die Entwicklung dieser Proteinfamilie sowie evolutionäre Schlüsselereignisse nachvollziehen, die letztlich zur Ausprägung Metall-spezifischer MT-Isoformen bei unterschiedlichen Gastropodenarten geführt haben. Zweitens möchten wir mit Hilfe von Mutagenese- Experimenten und gestützt auf Methoden des Bio-Engineerings MT-Mutanten und Protein-Chimären herstellen, die sich in Bezug auf ihre Metall-Spezifität nur geringfügig voneinander unterscheiden, um jene Strukturelemente in der Primärsequenz zu identifizieren, die für die Ausprägung der Metall-Selektivität kritisch sind. Drittens möchten wir die Tertiärstruktur von ausgewählten nativen und mutierten MT-Varianten mit Hilfe von NMR- Techniken aufklären, um dadurch besser verstehen zu lernen, welche Modifikationen in der Primärstruktur der Peptidketten die tertiäre Proteinfaltung derart beeinflussen, dass infolgedessen Metall-Ionen mit definierten Bindungs-stöchiometrischen Erfordernissen bevorzugt gebunden werden. Viertens möchten wir die Implikationen dieser strukturellen Protein-Diversifizierung in Hinblick auf ihre Metall-spezifischen, physiologisch-funktionellen Auswirkungen untersuchen. Die Realisierung dieses Vorhabens wird sich auf zahlreiche Kooperationen stützen. Im Zentrum des Projektes steht (als ein sogenanntes DACH-Projekt) die Kooperation zwischen Dr. Reinhard Dallinger (Institut für Zoologie, Universität Innsbruck) und Dr. Oliver Zerbe (Institut für Organische Chemie, Universität Zürich). Dr. Dallinger wird, abgesehen von seinen fach-spezifischen Beiträgen auf dem Gebiet der Biochemie und Physiologie von Gastropoden-MTs, als Projekt-Koordinator tätig sein. Der unverzichtbare Beitrag von Dr. Zerbe wird in der NMR- basierten Aufklärung der Tertiärstruktur ausgewählter nativer und experimentell mutierter Gastropoden-MTs liegen. Zusätzlich wird Dr. Herbert Lindner als nationaler Forschungspartner (Abteilung für Klinische Biochemie, Medizinische Universität Innsbruck) mit seiner Erfahrung auf dem Gebiet der Protein-Analytik unsere Forschungs- Bemühungen wesentlich unterstützen. Unverzichtbar für das Gelingen unseres Vorhabens wird darüber hinaus die Kooperation mit Dr. Silvia Atrian (Abteilung für Genetik, Universität Barcelona, Spanien) und Dr. Mercé Capdevila (Abteilung für Chemie, Autonome Universität Barcelona, Spanien) sein: Frau Dr. Atrian wird für die systematisch geplante, rekombinante Synthese ausgewählter Wildtyp- und mutierter MT-Varianten zuständig sein. Diese werden von Dr. Capdevila und ihrem Team übernommen und in einem chemischen Screening-Programm mit Hilfe spektrophotometrischer und massenspektroskopischer Verfahren auf ihre wichtigsten Metallbindungs- Eigenschaften (Homogenität, Stabilität und Stöchiometrie der MT-Metall-Komplexe) geprüft werden. Gestützt auf dieses analytische Screening-Verfahren sollen dann jene nativen und mutierten MT-Varianten ausgewählt werden, die in der Folge einer eingehenderen biochemischen, strukturellen und physiologischen Untersuchung durch alle anderen Projektpartner unterzogen werden.

Mit etwa 80.000 bekannten Arten repräsentieren Schnecken (Gastropoda) eine seit dem Kambrium (ca. 500 Millionen Jahre) nachweisbare Klasse der Weichtiere (Mollusca). Dank ihrer außerordentlichen Widerstandsfähigkeit gegenüber widrigen Umweltbedingungen konnten sich Schnecken erfolgreich an fast alle Lebensräume dieser Erde anpassen. Zahlreiche Schneckenarten sind in der Lage, enorme Konzentrationen an toxischen Metallen, wie etwa Cadmium oder Blei, in ihren Organen anzureichern und zu entgiften, weshalb sie als Bio-Indikatoren für Metallbelastungen in der Umwelt herangezogen werden. Die Fähigkeit von Schnecken zur Cadmium-Entgiftung auf der Komplexbindung dieses giftigen Metalls durch eine Familie von Entgiftungsproteinen, die auch in anderen Tieren vorkommen und als Metallothioneine (MTs) bezeichnet werden. Im Unterschied zu den meisten anderen Tierarten besitzen Schnecken-MTs jedoch eine ausgeprägte Spezifität für Cadmium, sodass dieses äußerst toxische Metall von Schnecken besonders effizient entgiftet werden kann. Diese Fähigkeit hat sich im Lauf der Evolution entwickelt, lange noch bevor der Mensch seine Umwelt durch erhöhte Cadmium-Emissionen belastet hat. Im vorliegenden Projekt sollte untersucht werden, wann, warum und wie sich Cadmium- spezifische MTs bei Schnecken evolviert und bis heute differenziert haben. In Kooperation mit Wissenschaftlern aus Spanien und der Schweiz wurde unter Einbeziehung molekularbiologischer, biochemischer und strukturbiologischer Methoden zunächst die dreidimensionale Struktur von Cadmium-spezifischen MTs zweier verschiedener Arten (der terrestrischen Weinbergschnecke und der Strandschnecke) aufgeklärt. Dank des Einsatzes zoologischer und evolutionsbiologischer Methoden konnte des Weiteren nachgewiesen werden, dass Cadmium-spezifische MTs bei verschiedenen Gastropoden-Gruppen vor etwa 430 Millionen Jahren durch konvergente Evolution unterschiedlicher Metall-bindender Domänen entstanden sind, und dass diese Cadmium-Spezifität im Verlauf der Evolution durch Struktur-Optimierung der betreffenden Domänen verbessert wurde. Dabei haben die durch supervulkanische Aktivität in die Umwelt freigesetzten Cadmium-Konzentrationen im Verlauf der Erdgeschichte diese Entwicklung vorangetrieben. Etwa seit dem Beginn der Kreidezeit vor 145 Millionen Jahren haben sich die Schnecken-MTs durch Anpassung der verschiedenen Gastropoden-Gruppen an neue Lebensräume diversifiziert, ihre Metall- Spezifität teilweise verändert oder sogar wieder verloren, abhängig von der Höhe der natürlich vorkommenden Cadmium-Konzentration in den neu eroberten Lebensräumen. Somit konnte gezeigt werden, dass das toxische und nicht-essentielle Schwermetall Cadmium ein wesentlicher Trigger der Evolution einer der wichtigsten Familien von Entgiftungsproteinen war und ist.