Knock-out Mäuse und Zellmodelle für muskuläre Plectinopathien

Epidermolysis bullosa (EB)-MD, verbunden mit progressiver Muskelschwäche und schweren Hautschäden, ist die häufigste durch Plectindefekte verursachte Krankheit. EB-MD Patienten und Plectin-defiziente Mäuse weisen die für MFM charakteristische massive Desmin-Aggregation auf. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass 4 Isoformen von Plectin eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der Funktionsfähigkeit von Muskelfasern spielen, da sie Desmin Intermediärfilament-Netze an Z-Disks, Costamere, Mitochondrien und dem Kern/SR- Membransystem verankern. Einer der wichtigsten Fortschritte des laufenden Projekts war die Etablierung von immortalisierten Plectin-defizienten Myozyten-Zelllinien, bei denen während der Differenzierung zu kontraktilen Myotuben spontan Desmin-Aggregation auftritt. Unter Verwendung dieser neuen, das experimentelle Arbeiten wesentlich erleichternder Systeme und einer umfangreichen Kollektion von konditionellen (MCK-Cre/Pax7-Cre) und Muskel-Isoform-spezifischen Plectin-knockout Mauslinien, sind im Folgeantrag folgende Ziele angepeilt: i) Untersuchung der molekularen Pathogenese von Plectin-MFMs mit Schwerpunkt auf Mechanismen die zum Zusammenbruch des Desmin-Netzwerks führen, Identifikation von Plectin-Isoform-spezifischen Interaktionspartnern, und Funktionsstörung neuromuskulärer-Endplatten; ii) Erprobung neuer Konzepte zur Behandlung phänotypischer Merkmale (Unterdrückung von Proteinaggregat-Bildung, Gentransfer); und iii) Analyse biomechanischer Eigenschaften Plectin-defizienter Myozyten und Muskelfasern.

Die bei Plectindefizienz am häufigsten auftretende Krankheit, Epidermolysis bullosa (EB)-MD, ist durch muskuläre Dystrophie und Hautablösung gekennzeichnet. EB-MD Patienten sowie Plectin-defiziente Mäuse weisen massive Proteinaggregation im Skelettmuskel auf, ein Merkmal für myofibrilläre Myopathie (MFM). Es gelang uns Zellkultursysteme zu etablieren die die pathologischen Merkmale von MFM weitgehend wiederspiegeln. Diese dienten uns, zusammen mit einem Repertoire an Plectin-defizienten Mauslinien, zu Studien mit folgenden Zielsetzungen: i) Aufklärung der durch Plectin und Intermediärfilamente (Desmin-IFs) vermittelten intrazellulären Vernetzungsmechanismen, speziell kontraktile Muskelfibrillen, Zellkerne, Mitochondrien, und neuromuskulärer Endplatte (NMJ) betreffend. ii) Entwicklung und Erprobung im Tierversuch von Behandlungs- und Gentransfer-Strategien zur Beseitigung von Proteinaggregaten in MFM Muskelzellen. iii) Analyse der mechanischen Eigenschaften und Signaltransduktion von mechanischen Reizen in Plectin-defizienten Muskelzellen.Zielsetzung (i) betreffend konnten wir zeigen, dass eine der Plectinisoformen, P1, durch Rekrutieren von Desmin-IFs an Zellkerne deren Morphologie und Genexpression beeinflusst und somit wichtig für die Signaltransduktion in Muskelzellen ist. Als ähnlich wichtig erwiesen sich die Isoformen P1d und P1b für Morphogenese und Funktionstüchtigkeit von kontraktilem Apparat und Mitochondrien, während P1f essentiell für NMJ-Integrität und Glukoseaufnahme ist. Die unter (ii) erzielten Ergebnisse waren höchst zufriedenstellend, konnte doch mit einem sogenannten chemischen Chaperon (4-PBA), eine Substanz gefunden werden, die zur Vermeidung von Proteinaggregation in MFM Zellkulturen und Muskelfasern, sowie zu verbesserter Muskelleistung von MFM Mäusen führt. Dieses Projekt war die Grundlage für derzeit im Gange befindliche Initiativen zur Durchführung klinischer Tests mit MFM Patienten. Ferner wurden cDNA-Expressionsplasmide für Plectin-Minigene zur therapeutischen Anwendung bei Mäusen (und gegebenenfalls Patienten) hergestellt und erprobt. Hinsichtlich Zielsetzung (iii) konnten wir zeigen, dass die Funktionsuntüchtigkeit von Plectin, insbesondere von bestimmten Isoformen, schwerwiegende Auswirkungen auf Steifheit, Adhärenzvermögen und Cytoskelettdynamik von Muskelzellen hat. In mehreren komplementären Studien wurde die zentrale Rolle von Plectin bei mechanisch induzierter Signaltransduktion in diversen (nicht muskulären) Zellsystemen bestätigt, unter ihnen vaskuläre Endothelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten, und verschiedene Tumorzellsysteme. In Summe, die aus dem Projekt gewonnenen neuen Erkenntnisse lassen uns die zu Plectinopathien führenden molekularen Vorgänge besser verstehen und eröffnen erstmals einen Weg zur möglichen Behandlung derartiger Krankheiten. Ohne Zweifel profitierte unser Projekt vom kooperativen Zusammenwirken mehrerer Arbeitsgruppen innerhalb des internationalen Forschungsprogramms Molecular Pathogenesis of Myofibrillar Myopathies.