Analyse der Funktion von VPS13A in aus iPS Zellen hergestelltenerythroiden Zellen (EMINA-2)

Chorea-Acanthozytose (ChAc) ist eine seltene, verheerende neurodegenerative Erkrankung, die durch Mutationen im VPS13A Gen hervorgerufen wird. Obwohl das Gen, in dem Mutationen die Krankheit verursachen, identifiziert wurde, bleibt die Pathogenese rätselhaft. Das ist teilweise auf Eigenschaften des VPS13A Proteins zurückzuführen, aber auch auf die relativ geringen Patientenzahlen weltweit, welche die Forschung an dieser Krankheit erschwerten. Ein charakteristisches Merkmal von ChAc Patienten sind die namensgebenden, sternförmig deformierten und als Acanthozyten bezeichneten Erythrozyten im Periphärblut, welche oft das erste Anzeichen der Erkrankung darstellen. Das VPS13A Protein, das höchstwahrscheinlich mit Transportprozessen zu/von den Lysosomen zu tun hat, wird sowohl in Neuronen als auch in Erythrozyten exprimiert. Die Mutationen im VPS13A-Gen werden deshalb sowohl für den neurodegenerativen, als auch für den acanthozytären Phänotyp verantwortlich gemacht. Primärkulturen von Neuronen von ChAc-Patienten sind für die Forschung nicht möglich. Als Alternative dazu wurden während des EMINA-Projektes induzierte, pluripotente Stammzellen (iPS Zellen) hergestellt, die jetzt zur Verfügung stehen, um unser Wissen über ChAc zu erweitern. Neuronale Differenzierung aus diesen patientenspezifischen iPS Zellen wurde gezeigt. Trotz dieser Fortschritte gibt es bei der neuronalen Differenzierung noch einige Einschränkungen. So ist zum Beispiel die Herstellung großer Zellmengen (zB für biochemische Analysen) kaum durchführbar. Aus diesem Grund werden an der Medizinischen Universität Wien die patientenspezifischen iPS Zellen in erythroide Zellen differenziert werden, um auf diese Weise die wichtige Arbeit unserer Projektpartner, die mit neuronalen Zellen arbeiten, zu komplementieren. Die erythroide Differenzierung aus iPS Zellen wurde schon gezeigt und liefert schnell proliferierende erythroide Vorstufen, die die Erzeugung von hohen Zellzahlen erlauben und biochemische und zellbiologische Experimente ermöglichen, die mit neuronalen Zellen nicht durchführbar wären. Unser erstes Ziel ist die Etablierung eines in vitro Protokolls zur Differenzierung von patientenspezifischen iPS Zellen mit bekannten VPS13A Mutationen in reife Erythrozyten. Diese Erythrozyten werden mithilfe von Methoden, die im EMINA-Projekt entwickelt wurden (zB Phalloidin-Färbung und konfokale Analyse von Acanthozyten oder Medikament-induzierte Endovesikulierung), auf morphologische und funktionelle Defekte überprüft. Der Zugang, iPS Zellen als Ausgangsmaterial zu verwenden, eröffnet auch die Möglichkeit, den lysosomalen/endosomalen Transport in unreifen, kernhältigen Erythrozytenvorstufen zu untersuchen. Wir werden auch die erfolgreiche biochemische Analyse von Blutproben von ChAc Patienten weiterführen und ausweiten, um aussagekräftige Probenzahlen zu erreichen. Zusätzlich werden wir auch eine grundlegende Analyse der VPS13A- Expression (mRNA und Proteinlevels), der sub-zellulären Lokalisation und Funktion während der erythroiden Differenzierung durchführen. Um funktionelle Eigenschaften zu untersuchen, werden siRNA oder shRNA- induzierte Knock-down Experimente durchgeführt werden. Für die äußerst wichtige Identifizierung von Bindungspartnern von VPS13A wird die Tandem Affinity Purification (TAP)-Technik verwendet werden. Zur Identifizierung von Signaltransduktionswegen, die in ChAc-Patienten beeinträchtigt sind, werden wir erythroide Zellen aus Patienten-iPS Zellen mit Kontrollzellen vergleichen. Dafür werden Proteome Profiler arrays (Fa. R&D Systems) verwendet werden. Diese Versuche werden einen Einblick in die veränderte Signaltransduktion ermöglichen.

Im Rahmen des internationalen, kollaborativen Projektes EMINA-2 konnten durch die Zusammenarbeit von Arbeitsggruppen mit unterschiedlicher Expertise neue Erkenntnisse über die seltene Neurodegenerative Erkrankung Neuroakanthozytose gewonnen werden. Derzeit gibt es nur die Möglichkeit einer palliativen, die Krankheitssymptome mildernden Behandlung. Die genetischen Ursachen für die Neuroakanthozytose, Mutationen im VPS13A-Gen, sind schon seit über 15 Jahren bekannt, aber warum dieser genetische Defekt die Erkrankung auslöst, ist derzeit noch unklar. Grundvoraussetzung für eine zielgerichtete Behandlung ist ein Verständnis der normalen Funktion von VPS13A im Körper, speziell natürlich in den von der Krankheit betroffenen Geweben (Nervenystem und blutbildende Zellen im Knochenmark). An der Medizinischen Universität Wien konzentrierten wir uns zunächst auf die Funktion von VPS13A in Erythrozyten und konnten durch biochemische Untersuchungen einige Unklarheiten über die Membranverankerung dieses Proteins ausräumen. Unsere Versuche zeigten eindeutig, dass VPS13A ein peripheres Membranprotein ist, welches aber stark mit der Membran assoziiert ist. Im nächsten Schritt beschlossen wir, die Funktion des Proteins in einem Zellkulturmodell weiter zu untersuchen, und konnten erstmalig zeigen, dass das Fehlen von VPS13A in-vitro zu einer verstärkten Adhäsion an Proteine der extrazellulären Matrix wie Fibronectin führt und die Signalweiterleitung über Focal Adhesion Kinase (FAK)- und (wahrscheinlich dadurch induziert) Extracellular Signal Related (ERK)-Signalkaskaden maßgeblich beeinflußt. Diese Ergebnisse stellen eine Verbindung zur von anderen Gruppen beobachteten Veränderung des Actin-Zytoskeletts und eventuell auch zum publizierten Autophagie-Defekt her, und werden uns helfen, die Krankheitsentstehung besser zu verstehen. Der Adhäsions-Phänotyp konnte auch in primären Zellen von Patienten beobachtet werden. Die internationale Zusammenarbeit erlaubte uns auch, die Kultivierung und Differenzierung von patientenspezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) von unseren Projektpartnern in Dresden zu erlernen und Differenzierungen in Richtung hämatopoietischer Zellen durchzuführen. Durch ein einmonatiges Fellowship an der Mount Sinai University in New York bei Ruth Walker, einer der Expertinnen auf dem Gebiet der Neuroacanthozytose, war es schließlich auch noch möglich, Gehirnschnitte von PatientInnen zu analysieren. Dabei konnten wir erstmalig in Patientengewebe Aggregate von Poly-Ubiquitinylierten Proteinen beobachten. Diese Ergebnisse könnten die klinische Betrachtung von Neuroakanthozytose als Neurodegenerative Erkrankung ohne Proteinaggregate nachhaltig verändern.