Identifizierung von in vivo-Substraten von MEK-MPK-Modulen in Arabidopsis

Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MPKs) kommen in allen Eukaryoten vor. Sie setzen extrazelluläre Signale in intrazelluläre Reaktionen um und bewirken dabei eine Verstärkung des übertragenen Signals. Die Identität der Protein-Substrate von MPKs ist bislang noch weitgehend unbekannt; vermutlich weil viele dieser Protein-Substrate in nur geringen Mengen in der Zelle vorliegen. Ein oft gewählter Ansatz zur Identifikation von Phosphoproteinen und ihren Phosphorylierungsstellen in komplexen biologischen Proben ist die Anreicherung von Phosphopeptiden aus enzymatisch verdauten Zell-Lysaten mit anschließender Massenspektrometrie. Dieser Ansatz erlaubt zwar die Identifizierung von Phosphopeptiden, die in größeren Mengen in der Zelle vorhanden sind, niedrig abundante Phosphopeptide werden mit dieser Methode aber nicht erfasst. Wir verwenden im hier vorgeschlagenene Projekt eine verlässliche und selektive Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von spezifischen Phosphorylierungsereignissen an MPK-Substraten, die in Arabidopsis thaliana in nur geringen Mengen vorliegen. Die Methode nutzt die sukzessive Anreicherung zunächst von Phosphoproteinen und danach von Phosphopeptiden. Der Ansatz verbindet die Proteinextraktion unter denaturierenden Bedingungen mit einer Phosphoprotein- Anreicherung durch Al(OH)3 -basierte Metalloxid-Affinitätschromatographie (MOAC), tryptischen Verdau der angereicherten Phosphorotein-Fraktion und anschließender TiO2 -basierter MOAC der Phosphopeptide. Wir präsentieren Vorarbeiten, die das große Potenzial dieser "Phosphoproteomics"-Strategie durch Identifizierung und Quantifizierung von einzelnen Phosphorylierungsstellen in einigen bereits bekannten und mehreren neuen potenziellen in vivo-Substraten von MPK3/6 in Arabidopsis belegen. Wir planen, eine möglichst große Anzahl von MPK-Substraten in Arabidopsis zu identifizieren und diese anschließend funktionell zu charakterisieren. Da MPKs an der Regulation von vielen verschiedenen zellulären Reaktionen in allen Eukaryoten beteiligt sind, werden die Ergebnisse des hier vorgeschlagenen Projekts vermutlich nicht nur für die Pflanzenbiologie, sondern auch für andere bereiche der Lebenswissenschaften relevant sein.

Die Interaktion aller Lebewesen mit ihrer Umwelt bedingt die Erkennung vieler verschiedener Informationen und deren Weiterleitung an einen zentralen Ort des Prozessierens. Eine der wichtigsten solcher Signaltransduktionsketten ist die Mitogen Assozierte Protein Kinase (MAPK) Kette. Im Wesentlichen besteht sie aus drei in Serie geschalteten Protein-Modulen, den MAPK Kinase Kinasen (MEKK), MAPK Kinasen (MEK) und den MAP Kinasen (MPK). Nach Erkennung eines Stimulus werden diese Proteine durch reversibles kovalentes Anhängen einer oder zweier Phosphorylgruppen an- bzw- ausgeschaltet. Das letzte Glied dieser Signalübermittelungskette, die MPK, überträgt dann eine oder mehrere Phosphorylgruppen auf ein Zielprotein was zu einem Prozessieren des und einer entsprechenden Reaktion auf das erhaltene Signal führt. Organismen denen die wichtigsten dieser MAP Kinasen fehlen etwa durch Genmutation sind nicht lebensfähig, was die zentrale Bedeutung dieser Proteine eindrucksvoll unterstreicht.Auf Grund dieser überaus wichtigen Stellung der MAP Kinase Ketten ist es naheliegend, dass sie allerlei Proteine mit diversen Funktionen aktivieren. Zu dem Zeitpunkt des Projektbeginns waren jedoch nur eine Handvoll solcher MPK Zielproteine, auch MPK Substrate genannt bekannt. Das Ziel dieses Projektes war es die potentielle Vielfalt der noch nicht bekannten aber erwarteten MPK Substrate zu entdecken und damit einhergehend, die Rolle der MAP Kinase Signaltransduktion in der Regulation einer Vielzahl zellulärer Prozesse in dem Arabidopsis thaliana zu beleuchten.Da die aktivierten MPK Substrate eine oder mehrere Phosphorylgruppen tragen die einen Zuwachs ihrer molekularen Masse bewirken ist die Massenspektrometrie, hervorragend für diese Aufgabe geeignet. Durch gezieltes anschalten der MPK Aktivität mittels Transgenen erhalten MPK Substrate in einer Pflanze bevorzugt Phosphorylgruppen im Vergleich zu einer anderen Pflanze mit unter normalen Wachstumsbedingungen schwacher MPK Aktivität. Im Zuge des Projektes wurde eine neue Technik entwickelt um diese aktivierten MPK Substrate anhand ihrer Phosphorylgruppen anzureichern und anschließend an der Universität Wien zu messen. Dieses Projekt war die erste Arbeit die mehr als 100 dezidierte, vorher noch unbekannte MPK Substrate direkt in der lebenden Pflanze (in vivo) identifizieren konnte. Die Arbeit bestätigte viele kursierende Vermutungen und gab neue Hypothesen zu der regulatorischen Wirkungsweise dieser zentralen Signaltransduktionsmechanismen in Pflanzen und anderen Organismen auf.