Aptamer-Liganden für die Photovernetzung mit RNA

In dem beantragten Projekt werde ich eine neue Klasse chemischer Verbindungen entwickeln, die mit sogenannten Aptameren interagieren können. Aptamere sind Nukleinsäuren (RNA oder DNA), die komplexe Strukturen annehmen und dabei eine Tasche bilden, die die Zielverbindung (Ligand) spezifisch erkennt. Üblicherweise bindet der Ligand reversibel an das Aptamer mittels nicht-kovalente Wechselwirkungen, d. h. Wasserstoffbrückenbindungen, Ionenpaare, oder durch hydrophobe Wechselwirkungen, z.B. Stapeln von aromatischen Systemen. Einige natürlich vorkommende RNA- Aptamere ändern ihre Struktur bei Ligandenbindung. So nutzt die Natur Aptamere zur Genregulation, indem sie Gene in Abhängigkeit von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen ein- oder ausschaltet (Riboschalter). Mit anderen Worten, wenn die Zielverbindung in der zellulären Umgebung vorhanden ist, interagiert der Schalter mit ihr, verändert ihre Form und beeinflusst damit die zelluläre Maschinerie normalerweise die Transkription (RNA-Synthese) oder die Translation (Protein- synthese). Diese Mechanismen sind bei Bakterien, aber auch bei einigen höheren Organismen sehr verbreitet und ermöglichen es der Zelle, auf sich ändernde Umweltbedingungen zu reagieren. Unter den Aptameren gibt es auch künstliche, die von ForscherInnen durch in-vitro-Selektion geschaffen wurden. Eine wichtige Klasse solcher Aptamere zeigt nach Bindung des (im ungebundenen Zustand nicht fluoreszierenden) Liganden Fluoreszenz. Diese sogenannten Light-up-Aptamere sind besonders nützlich für biotechnologische Studien, z.B. zum Nachweis von Nukleinsäuren sowohl in vitro als auch in Zellen. In meinem Projekt beabsichtige ich, Aptamere mit erhöhter Leistung zu entwickeln. Basierend auf den bekannten Liganden für Aptamere, werde ich ähnliche Verbindungen synthetisieren, die jedoch darüber hinaus zur "Photovernetzung" befähigt sein werden. Dieser Prozess beginnt mit UV- Bestrahlung, die zur Bildung einer stabilen (kovalenten) Bindung zwischen dem Liganden und dem Aptamer führt. Dadurch verbleibt der Ligand in der Tasche des Aptamers, der Aptamer-Ligand- Komplex wird eingefroren und im Idealfall eine bestimmte Funktion beständig ausgeführt. Die in diesem Projekt entwickelten neuartigen photovernetzenden Liganden sind vielversprechende Werkzeuge für die Biowissenschaften. Im Falle von aufleuchtenden Aptameren werde ich Ligand- RNA-Systeme entwickeln, die für die RNA-Bildgebung und -Lokalisation in vitro und in vivo, für die Identifizierung neuer zellulärer RNAs, und für die RNA-Reinigung nützlich sein werden. Außerdem beabsichtige ich gründlich zu untersuchen, wie die kovalente Verknüpfung zwischen Aptamer und Chromophoren das Absorptions-/Fluoreszenzverhalten verändert. In Bezug auf die natürlich vorkommenden Aptamere werde ich Liganden entwickeln, die für die Isolierung und Identifizierung von RNA-Riboschaltern und für die Aufklärung ihrer Rolle im Stoffwechsel und der Genregulation nützlich sind.