Aptamer-Liganden für die Photovernetzung mit RNA

In dem beantragten Projekt werde ich eine neue Klasse chemischer Verbindungen entwickeln, die mit sogenannten Aptameren interagieren können. Aptamere sind Nukleinsäuren (RNA oder DNA), die komplexe Strukturen annehmen und dabei eine Tasche bilden, die die Zielverbindung (Ligand) spezifisch erkennt. Üblicherweise bindet der Ligand reversibel an das Aptamer mittels nicht-kovalente Wechselwirkungen, d. h. Wasserstoffbrückenbindungen, Ionenpaare, oder durch hydrophobe Wechselwirkungen, z.B. Stapeln von aromatischen Systemen. Einige natürlich vorkommende RNA- Aptamere ändern ihre Struktur bei Ligandenbindung. So nutzt die Natur Aptamere zur Genregulation, indem sie Gene in Abhängigkeit von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen ein- oder ausschaltet (Riboschalter). Mit anderen Worten, wenn die Zielverbindung in der zellulären Umgebung vorhanden ist, interagiert der Schalter mit ihr, verändert ihre Form und beeinflusst damit die zelluläre Maschinerie normalerweise die Transkription (RNA-Synthese) oder die Translation (Protein- synthese). Diese Mechanismen sind bei Bakterien, aber auch bei einigen höheren Organismen sehr verbreitet und ermöglichen es der Zelle, auf sich ändernde Umweltbedingungen zu reagieren. Unter den Aptameren gibt es auch künstliche, die von ForscherInnen durch in-vitro-Selektion geschaffen wurden. Eine wichtige Klasse solcher Aptamere zeigt nach Bindung des (im ungebundenen Zustand nicht fluoreszierenden) Liganden Fluoreszenz. Diese sogenannten Light-up-Aptamere sind besonders nützlich für biotechnologische Studien, z.B. zum Nachweis von Nukleinsäuren sowohl in vitro als auch in Zellen. In meinem Projekt beabsichtige ich, Aptamere mit erhöhter Leistung zu entwickeln. Basierend auf den bekannten Liganden für Aptamere, werde ich ähnliche Verbindungen synthetisieren, die jedoch darüber hinaus zur "Photovernetzung" befähigt sein werden. Dieser Prozess beginnt mit UV- Bestrahlung, die zur Bildung einer stabilen (kovalenten) Bindung zwischen dem Liganden und dem Aptamer führt. Dadurch verbleibt der Ligand in der Tasche des Aptamers, der Aptamer-Ligand- Komplex wird eingefroren und im Idealfall eine bestimmte Funktion beständig ausgeführt. Die in diesem Projekt entwickelten neuartigen photovernetzenden Liganden sind vielversprechende Werkzeuge für die Biowissenschaften. Im Falle von aufleuchtenden Aptameren werde ich Ligand- RNA-Systeme entwickeln, die für die RNA-Bildgebung und -Lokalisation in vitro und in vivo, für die Identifizierung neuer zellulärer RNAs, und für die RNA-Reinigung nützlich sein werden. Außerdem beabsichtige ich gründlich zu untersuchen, wie die kovalente Verknüpfung zwischen Aptamer und Chromophoren das Absorptions-/Fluoreszenzverhalten verändert. In Bezug auf die natürlich vorkommenden Aptamere werde ich Liganden entwickeln, die für die Isolierung und Identifizierung von RNA-Riboschaltern und für die Aufklärung ihrer Rolle im Stoffwechsel und der Genregulation nützlich sind.

Im Rahmen des vorgeschlagenen Projekts wurde eine neue Klasse chemischer Verbindungen entwickelt, die mit sogenannten Aptameren interagieren können. Aptamere sind Nukleinsäuren (RNA oder DNA), die komplexe dreidimensionale Strukturen annehmen können und dadurch eine Bindungstasche bilden, die eine bestimmte Zielverbindung (einen Liganden) spezifisch erkennt. In der Regel bindet der Ligand reversibel an das Aptamer über nichtkovalente Wechselwirkungen, wie Wasserstoffbrücken, Ionenpaare oder hydrophobe Wechselwirkungen (z. B. Stapelwechselwirkungen). Einige natürlich vorkommende RNA-Aptamere verändern ihre Struktur nach der Bindung eines Liganden. Auf diese Weise nutzt die Natur Aptamere zur Genregulation, indem Gene in Abhängigkeit von der Ligandenkonzentration ein- oder ausgeschaltet werden. Diese regulatorischen Elemente, sogenannte Riboswitches, interagieren mit einer bestimmten Verbindung in der zellulären Umgebung. Nach der Bindung verändert das Aptamer seine Konformation und beeinflusst dadurch die zelluläre Maschinerie - meist die Transkription (RNA-Synthese) oder die Translation (Proteinsynthese). Solche Mechanismen sind in Bakterien weit verbreitet, kommen jedoch auch in einigen höheren Organismen vor und ermöglichen es den Zellen, auf veränderte Umweltbedingungen zu reagieren. Neben natürlichen Aptameren wurden auch künstliche Aptamere entwickelt, die von Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern mithilfe von In-vitro-Selektionsverfahren hergestellt werden. Eine wichtige Klasse dieser künstlichen Aptamere zeigt Fluoreszenz nach der Bindung eines spezifischen, an sich nicht fluoreszierenden Liganden. Diese sogenannten "Light-up"-Aptamere sind besonders nützlich in der Biotechnologie, beispielsweise zum Nachweis von Nukleinsäuren sowohl in vitro als auch in lebenden Zellen. In diesem Projekt wurden Aptamere mit verbesserter Leistungsfähigkeit entwickelt. Auf der Grundlage bekannter Verbindungen, die als Liganden für Aptamere dienen, wurden strukturell verwandte Moleküle synthetisiert, die zur Photokreuzvernetzung fähig sind. Dieser Prozess wird durch UV-Bestrahlung ausgelöst und führt zur Bildung einer stabilen kovalenten Bindung zwischen dem Liganden und dem Aptamer. Infolgedessen bleibt der Ligand dauerhaft in der Bindungstasche des Aptamers eingeschlossen, wodurch die Aptamerstruktur gewissermaßen "eingefroren" wird und idealerweise eine kontinuierliche Fluoreszenz entsteht. Die im Rahmen dieses Projekts entwickelten neuartigen photokreuzvernetzenden Liganden stellen einen ersten Schritt hin zu einer neuen Klasse kontinuierlich fluoreszierender Aptamere dar. Obwohl die synthetisierten Liganden relativ geringe Bindungsausbeuten an das Aptamer zeigten - was für diese Art von Wechselwirkung typisch ist -, konnten die gewünschten kovalenten Komplexe erfolgreich erhalten werden. Dadurch war es möglich, die spektroskopischen und fluoreszenzbezogenen Eigenschaften der entstandenen Addukte zu bestimmen, sie mit nichtkovalent gebundenen Aptamer-Ligand-Komplexen zu vergleichen und die genaue Bindungsweise des Liganden im Aptamer zu identifizieren.