Mechanismen der IRES vermittelten Expression von Laminin B1 in der Metastasierung

Laminin B1 ist ein Protein der extrazellulären Matrix, das die Migration und Invasion von Krebszellen reguliert. Metastasierung ist häufig mit der Umwandlung epithelialer Karzinomzellen zu einem mesenchymalen Phänotyp (EMT) verbunden, wodurch Tumorzellen die Dissemination ermöglicht wird. Maligne Hepatozyten durchlaufen eine EMT durch die Kooperation des H-Ras und Transforming Growth Factor (TGF)-ß Signalweges. In EMT- transformierten Hepatozyten konnte eine erhöhte Translation von Laminin B1 (LamB1) beobachtet werden. Es stellte sich heraus, dass die gesteigerte Translation von LamB1 durch eine Interne Ribosomen- Bindungsstelle (IRES) reguliert wird, welche in der 5`-untranslatierten Region (UTR) des LamB1 Transkripts lokalisiert ist. Der IRES transaktivierende Faktor (ITAF) La wurde als Bindungspartner der LamB1 IRES identifiziert. La interagiert mit dem IRES Motif im Zytoplasma und verstärkt die IRES Aktivität vom LamB1 in EMT-transformierten Hepatozyten. Die Translokation von La aus dem Zellkern in das Zytoplasma wird durch den TGF-ß regulierten Platelet Derived Growth Factor (PDGF) Signalweg bewirkt. Das Ziel dieses Projekts ist die Relevanz der IRES vermittelten Translation von LamB1 in der Tumorigenese zu untersuchen. Als erstes werden wir die Expression von LamB1 in epithelialen und EMT-transformierten Zellen nach "Knock-down" von LamB1 rekonstituieren. Dazu werden Expressionsvektoren verwendet, welche die vollständige LamB1 5`-UTR oder eine LamB1 5`- UTR ohne IRES Aktivität enthalten. Diese Zelllinien erlauben die Auswirkung der IRES abhängigen Translation auf Angiogenese und Metastasierung nach Xeno- und Allotransplantation in Mäusen zu untersuchen. Die IRES Aktivität von LamB1 in experimentellen Tumoren und Metastasen wird mit Hilfe eines bicistronischen Reportervektors ermittelt. Ein weiteres Ziel ist die Identifikation von ITAFs, welche die LamB1 IRES Translation per se, oder in Kooperation mit La, aktivieren. Dazu wird die subzelluläre Lokalisation der identifizierten ITAFs und dessen Regulation im Zuge der EMT untersucht. Im Besonderen wird die posttranslationelle Modifikation von La und dessen Auswirkung auf die zytoplasmatische Lokalisation analysiert. Dieser Ansatz wird auf die Untersuchung der ITAFs in Patienten mit hepatozellulären Karzinomen (HCC) erweitert. Die subzelluläre Verteilung der ITAFs in kryokonservierten HCC Proben wird durch Fraktionierung bestimmt und mit der LamB1 Expression, dem Tumorgrad, der Zellinvasion in Blutgefäßen und dem Überleben der Patienten korreliert. Diese Studie wird neue Einsichten in die IRES vermittelte Translation von LamB1 während der Karzinogenese ermöglichen und das therapeutische Potential einer Hemmung der IRES Translation zur Behandlung von Krebs zeigen.

Hauptgrund für eine schlechte Prognose bei Krebserkrankungen ist das Auftreten von Metastasen. Bei der Metastasierung lösen sich Krebszellen vom Tumor und bilden an einer anderen Stelle im Körper Tochtergeschwülste. Die Ursache dafür ist die Aktivierung eines Zellprogramms namens EMT (Epithelial to Mesenchymal Transition) bei dem die Kontakte zwischen den einzelnen Tumorzellen abgebaut werden und das so die Abspaltung metastasierender Zellen vom Tumor ermöglicht wird. Im Rahmen dieses Programms erhöht sich die Produktion von Laminin B1 (LamB1) , ein Protein das unter anderem die Bewegung der Zellen reguliert. In diesem Projekt wurde die Rolle von LamB1 während der Metastasierung von Leberkrebs untersucht. Es wurden neue Zusammenhänge und Mechanismen gefunden, die beleuchten das LamB1 auf die Metastasierung Einfluss nimmt und das Ziel zukünftiger Therapien sein könnte.Bei der Analyse von Patenten mit Leberkrebs wurden erhöhte Mengen an Laminin B1 vor allem an der Tumorgrenze in denjenigen Tumoren gefunden die Keratin 19 produzieren. Der mechanistische Zusammenhang wurde in humanen Zelllinien aufgeklärt und es konnte erstmals gezeigt werden das LamB1 die Produktion von Keratin 19 (K19) reguliert. Die Produktion von K19 in Leberkrebszellen ist das Merkmal einer De-differenzierung und mit einem besonders aggressiven Krankheitsverlauf assoziiert.Auch die Steuerung der Produktion von LamB1 selbst in den Keratin 19 positiven Tumoren und Zelllinien wurde untersucht. Der außergewöhnliche Mechanismus basiert auf einem strukturellen Element in der mRNA (IRES) von LamB1 dessen Aktivität während der Metastasierung erhöht wird und das Ziel einer Therapie werden könnte. Um herauszufinden ob LamB1 eine Rolle beim Ablauf das EMT Zellprograms spielt wurde es in den Leberkrebszellen ausgeschalten. Zellen die Fähigkeit verloren hatten LamB1 zu produzieren waren nicht mehr in der Lage nach der Auslösung des EMT Prozesses das Zell-Verbindungsprotein E-cadherin abzubauen und sich von den anderen Tumorzellen zu lösen. Umgekehrt begannen Zellen die den EMT Prozess bereits durchlaufen haben bei Verlust von LamB1 wieder E-cadherin zu bilden und Kontakte unter den Zellen herzustellen. Die Präsenz von LamB1 könnte daher wichtig für den Ablauf der Metastasierung sein.