In vivo induzierte Gene von Tetracapsuloides bryosalmonae

Inhalt des Forschungsprojektes: Tetracapsuloides bryosalmonae ist ein Endoparasit, der die proliferative Nierenerkrankung (PKD) in verschiedenen Arten von Salmoniden in Europa und Nordamerika verursacht. Die wirtschaftlichen Auswirkungen der Krankheit machen sie zu einem wichtigen Faktor für die Aquakultur. PKD steht im Verdacht zu dem Rückgang der Bachforellen- und Lachspopulationen in Europa beizutragen. T. bryosalmonae vervollständigt den Entwicklungszyklus in zwei Wirten, ein wirbelloser Wirt: Bryozoen und ein Wirbeltier: Bachforellen. Die Proliferation der Parasiten induziert eine granulomatöse zelluläre Antwort in den interstitiellen Geweben, die zu einer Schwellung der Niere und der Milz führt. Die Virulenzmechanismen von T. bryosalmonae sind nicht vollständig erforscht und über die Virulenzgene, welche während des Infektionsverlaufs im Fischwirt induziert und exprimiert werden und an der Pathogenität beteiligt sind, ist noch nichts bekannt. Hypothese: Unsere Arbeitshypothese ist, dass die Virulenzgene von T. bryosalmonae während der Entwicklung der Parasiten in den Fischen induziert und in vivo ausgedrückt werden. Diese Gene können zur Virulenz oder Pathogenität für Fische während des Infektionsprozesses beitragen. Wir identifizieren Virulenzgene von T. bryosalmonae, die in vivo exprimiert werden und die Pathogenität für Bachforellen im Verlauf der Infektion verursachen. Methoden: In diesem Projekt werden Bachforellen mit Sporen von T. bryosalmonae infiziert. Serum und Organe der Fische werden zu verschiedenen Zeitpunkten beprobt. EinecDNA- Bibliothek von T. bryosalmonae wird konstruiert und ein Immunoscreening der cDNA- Bibliothek wird unter Verwendung von adsorbierten Fischseren durchgeführt. Positive Klone werden durch quantitative Echtzeit -PCR in den infizierten Organen identifiziert und validiert. Zusätzlichwirdeine RNA-Sequenzierung von T.bryosalmonaezur Sequenzhomologieanalyse generiert. Neuer und einzigartiger Aspekt des Projekts: Das Projekt stellt die erste Untersuchung von Virulenzgenen und Antigenen von T. bryosalmonae, welche in vivo im Zuge der Entwicklung der Parasiten exprimiert werden, dar. Die Ergebnisse werden Einblicke in den Mechanismus der proliferativen Nierenerkrankung der Salmoniden geben. Die neuen Gene und Antigene können für Therapie- und Impfstoffanwendungen in Betracht gezogen werden. Darüber hinaus liefern Transkriptomprofile von T. bryosalmonae grundlegende biologische Informationen und helfen uns, die Krankheitsmechanismen dieser wichtigen Fischparasiten zu verstehen.

Die proliferative Nierenerkrankung (PKD) ist eine parasitäre Malacosporidiose, die sowohl gezüchtete als auch wilde Salmoniden in Europa und Nordamerika deutlich beeinträchtigen, wirtschaftliche Verluste verursachen und Wildfischpopulationen gefährden kann. PKD wird durch den Endoparasiten Tetracapsuloides bryosalmonae verursacht, dessen Entwicklungszyklus abwechselnd in Süßwasserbryozoen und Salmoniden erfolgt. Der Fisch-Parasit entwickelt sich meistens in der Niere, wurde aber auch in anderen Geweben gefunden. Die Proliferation des Parasiten in der Niere verursacht eine Schwellung durch Hyperplasie des interstitiellen Gewebes und eine granulomatöse Zellreaktion. Im Wirtsfisch werden während der Infektion Virulenz-Gene induziert und exprimiert, die für Krankheit und Pathogenität wichtig sind. Ziel des beantragten Projektes war es, T. bryosalmonae-Gene zu identifizieren, die in der Bachforelle Salmo trutta exprimiert werden und an ihrer Erkrankung im Verlauf der Infektion beteiligt sind. Dies wurde durch die Verwendung der In-vivo-induzierten-Antigen-Technologie erreicht, einer Immunscreening-Technik, die Parasiten-Antigene identifiziert, die während einer Infektion in Fischen in vivo exprimiert werden. Die Seren von Bachforellen, die T. bryosalmonae ausgesetzt waren, wurden gesammelt und Anti-T. bryosalmonae-Antikörper wurde in jeder Serumprobe mittels indirektem ELISA bestätigt. Die gepoolten Seren wurden gegen drei Formen von Parasitensäcken und E. coli XL1-Blue-Antigenen adsorbiert, um Antikörper in den Seren zu entfernen, die auf Antigene reagieren, die konstitutiv von T. bryosalmonae in der Körperhöhle von Bryozoen exprimiert werden. Die resultierenden adsorbierten Seren wurden zum Screenen einer T. bryosalmonae-cDNA-Phagenexpressionsbibliothek verwendet. Positive Klone wurden gescreent und sequenziert und ihre Sequenzen auf Homologie zu bekannten Genen analysiert. Quantitative Echtzeit-PCR wurde durchgeführt, um die Transkriptionsniveaus dieser Gene in infizierten Nieren und infizierten Bryozoen zu bestimmen. Zusätzlich wurde eine RNA-Sequenzierung von T. bryosalmonae-infizierten Bryozoen (Fredericella sultana), hinteren Nieren von Bachforellen und Parasitensäcken durchgeführt, um Transkriptomdaten zu generieren. Die Ergebnisse dieses Projekts zeigen, dass 136 in vivo induzierte Gene von T. bryosalmonae wie Calmodulin, das ras-verwandte Protein Rab-35 und das Vesikel-assoziierte Membranprotein 3 induziert und in der Bachforelle während der Parasitenentwicklung exprimiert werden. Diese Gene sind an mehreren Funktionen beteiligt, die für den Parasiten entscheidend sind, wie Signalübertragung, Transport, Bindung von Metallionen und Stoffwechselprozessen. Die identifizierten in vivo induzierten Gene könnten für die Entwicklung von Impfstoffen oder als Arzneimittel-Ansätze zur Behandlung von PKD bei Salmoniden verwendet werden. Die Ergebnisse der RNA-seq-Analyse von infizierten F. sultana und infizierten Nieren von Bachforellen bieten neue Einblicke in die Immunreaktion beider Wirtsorganimen gegen T. bryosalmonae. De-novo-Transkriptomanordnungen von Parasitensäcken und Zooiden von F. sultana werden eine wertvolle Ressource für die Genentdeckung und funktionelle transkriptomische Anwendungen sein.