Pharmacochaperoning des Dopamintransporters

Der Dopamintransporter (DAT) ist ein Neurotransmitter -Transporter (NTT), der zur solute carrier-6 (SLC6) Familie gehört; das Gen wird daher als slc6A3 bezeichnet. Die physiologische Rolle von DAT ist es, das zuvor freigesetzte Dopamin aus dem synaptischen Spalt zu entfernen und damit in einem Relais mit dem vesikulären Monoamin-Transporter (VMAT) die synaptischen Vesikeln wieder zu füllen. Punktmutationen in slc6A3 führen zu infantilen Dystonie/Parkinsonismus, weil sie vermutlich die Faltung von DAT beeinträchtigen. Daher wird fehlgefalteter DAT im endoplasmatischen Retikulum (ER). Im vorliegenden Antrag soll geprüft werden, ob die Faltung einiger dieser natürlich vorkommenden DAT Mutanten durch den Einsatz von verschiedenen niedermolekularen Verbindungen/Liganden (chemische und pharmakologische Chaperons) unterstützt werden kann, sodass die mutierten Transporter die Zelloberfläche erreichen. Ebenso soll auch noch einen Verwandter des DAT, der Noradrenalin-Transporter (NET) untersucht werden. Auch hier existieren Mutationen, die intrazellulär retiniert werden. Dies führt zum klinischen Bild der orthostatischen Intoleranz. Die Arbeitshypothese beruht auf einem Modell, in dem SLC6 Transporter (i) zunächst mit ER-residenten Chaperonen (z.B. Calnexin) und zytosolische Hitzeschock-Proteine (HSP) interagieren, (ii) nach Freigabe durch die luminalen Chaperone oligomerisieren, (iii) ihre endgültige/stabile Konformation erreichen, sodass die HSP vom C- Terminus des Transporters dissoziieren und (iv) damit das ER-Export-Motiv auf Transporter C-Terminus zugänglich wird. An dieses werden Proteine des Coatomer-II/COPII-Komplexes rekrutiert, die den ER Export ermöglichen. Dieses Modell basiert auf der folgenden experimentellen Evidenz: (i) Oligomer-Bildung ist für ER-Export von SLC6 Transporter erforderlich, (ii) das ER-Export-Motiv (d.h. die Bindungsstelle für SEC24, den Cargo- Rezeptor des COPII-Komplex) liegt in der C-Terminus von NTTs (zB GAT- 1/SERT/NET/DAT), (iii) diskrete Mutationen in SERT C-Terminus, einschließlich der SEC24- Bindungsstelle, führen zu Defekten in der Proteinfaltung. Transporter werden im ER synthetisiert und durchlaufen vor ihrem Export aus dem ER eine Qualitätskontrolle. Diese verhindert, dass unvollständig gefaltete Proteine die Plasmamembran ereichen. Es ist daher nicht überraschend, dass der C-Terminus eine Rolle bei der Proteinfaltung spielt. Ich postuliere, dass der C-Terminus zunächst durch ein Relais von Hitzeschockproteinen (HSP40-HSP70-HSP90) besetzt wird. Chemische Chaperons (wie 4-Phenylbuytrat und Dimethylsulfoxid) sind unspezifisch. Pharmakologische Chaperons, andererseits, zeigen hohe Spezifität. Ziel des Projekts ist es Bedingungen zu identifizieren, unter denen die im ER-retinierten DAT- und NET-Mutanten, an die Zelloberfläche gebracht werden können. Es ist offensichtlich, dass diese Untersuchungen von therapeutischer Relevanz sind.

Das wichtigste Ergebnis dieses Projekts war die Aufdeckung der molekularen Grundlagen eines klinischen Syndroms, das als infantile / juvenile Dystonie und Parkinsonismus bekannt ist. Nach aktuellem Wissensstand stehen Einzelpunktmutationen in jenem Gen, welches für den menschlichen Dopamintransporter (hDAT, SLC6A3) kodiert, mit dieser Krankheit in Verbindung. Die hauptsächliche physiologische Rolle von hDAT besteht darin, die Wiederaufnahme des Neurotransmitters Dopamin aus dem synaptischen Spalt zu vermitteln, wodurch eine schnelle Beendigung der Neurotransmission erreicht wird. Eine Dysfunktion des Transporters führt daher zu einer Anzahl von Dopamin-bezogenen Störungen, die von Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung und Depression bis zu Bewegungsstörungen und / oder Parkinsonismus reichen. Um den zugrunde liegenden Mechanismus zu entschlüsseln und die möglichen pharmakologischen Therapien zu erforschen, untersuchten wir dreizehn krankheitsassoziierte hDAT-Mutanten, die bei Kindern mit dieser schweren Störung auftreten. Wenn sie heterolog in HEK293-Zellen exprimiert wurden, zeigten alle Mutanten eine beeinträchtigte zelluläre Lokalisation. Sie wurden alle im endoplasmatischen Retikulumkompartiment der Zellen und nicht an der Plasmamembran zurückgehalten, wie es beim Wildtyp-hDAT-Protein der Fall ist. Wir fanden heraus, dass die Ursache dafür Proteinfaltungsdefekte in den Zellen sind. In drei der Mutanten, d.h. in hDAT-V158F, hDAT- G327R und hDAT-L368Q, konnte das Faltungsdefizit durch Behandlung mit dem Pharmakochaperon Noribogain oder dem Hitzeschockprotein 70 (HSP70) -Inhibitor Pifithrin- behoben werden, sodass sowohl der Export aus dem endoplasmatischen Retikulum als auch die Radioligand-Bindung sowie die Substrataufnahme durch diese DAT-Mutanten wiederhergestellt wurde. Bei der Fruchtfliege Drosophila melanogaster führt eine Funktionsschwäche der DAT zu einer verringerten Schlafdauer. Daher nutzten wir das Prinzip der gezielten transgenen Expression mutierter hDATs im Fliegensystem, um zu untersuchen, ob diese krankheitsverwandten hDAT- Varianten auch in einem intakten lebenden Organismus pharmakologisch gerettet werden können. Eine Behandlung mit Noribogain- oder Pifithrin- initiierte den Transport und die Abgabe von hDAT an die präsynaptischen Enden von dopaminergen Neuronen, somit wurde die Schlafdauer in DAT- defizienten (fumin) Drosophila-Linien, die hDAT-V158F oder hDAT-G327R exprimierten, wieder normalisiert. Andererseits verursachte die Expression von hDAT-L368Q in Drosophila melanogaster eine letale Entwicklungsstörung, wahrscheinlich aufgrund einer toxischen Wirkung, die durch Pharmacochaperoning nicht behoben werden konnte. Zusammenfassend identifizierten wir Mutationen, die für die pharmakologische Rettung von hDAT in den betroffenen Kindern geeignet sind. Darüber hinaus verdeutlichen unsere Ergebnisse die Herausforderungen bei der Übertragung von Erkenntnissen aus dem Pharmacochaperoning in Zellkultursystemen auf den klinischen Kontext. Aufgrund der evolutionären Konservierung der dopaminergen Neurotransmission zwischen Fliegen und Menschen können Studien wie diese uns erlauben, diese Lücke zu schließen.