Protein Kinase C Epsilon-induziertes Phosphoproteom

Protein Kinase C (PKC) ist eine Phospholipid-abhängige Serin/Threonin Kinase Familie, welche sich aus mindestens zehn eng verwandten Isoenzymen zusammensetzt. Die unterschiedlichen PKC Isoenzyme spielen eine tragende Rolle in vielen Kaskaden der Signalweiterleitung. Die exakte Rolle der einzelnen Isoenzyme, sowie deren Zielproteine in bestimmten Signalwegen, sind bislang nicht bekannt. Die Erkenntnis über Substratspezifität und Funktion verschiedener Isoenzyme hat deshalb einen sehr hohen Stellenwert. PKC epsilon (PKCeps) ist in vielen Geweben und Zelltypen im menschlichen Körper exprimiert und scheint eine essentielle Rolle in der Funktion des Nerven-, Immun- und Herz-Kreislaufsystems zu spielen. Die höchste Expression von PKCeps wurde im Gehirn nachgewiesen. Publikationen deuten auf ein gehäuftes Vorkommen von PKCeps im Wachstumskegel von aussprossenden Neuriten in differenzierenden neuronalen Zellen hin, um einerseits Einfluss auf die Signalweiterleitung des Nervenwachstumsfaktors (NGF) und der Transmitterfreisetzung zu nehmen und andererseits den Zelltod und das Überleben von Zellen zu steuern. Auf Grund der Tatsache, dass nur sehr wenige Substrate von PKC mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit identifiziert werden konnten, repräsentiert die Identifizierung von PKC Zielproteinen in Signalkaskaden den nächsten wichtigen Schritt in diesem Forschungsgebiet. In PC12 Phäochromozytom-Zellen, einem weit verbreiteten Modellsystem für neuronale Forschung, konnte PKCeps als wichtiger Faktor im NGF-induzierten Differenzierungsprozess, hin zu einem neuronalen Phänotyp, identifiziert werden. In diesem Forschungsprojekt wird vorgeschlagen quantitative Phosphoproteomics-Untersuchungen mit differenzierenden PC12 Zellen durchzuführen, um neuartige, physiologisch relevante Substrate von PKCeps zu finden und diese Interaktion biochemisch und molekularbiologisch zu verifizieren. Es wird vorgeschlagen (1) proliferierende PC12 Kontrollzellen mit (2) NGF-induzierten Zellen, (3) NGF induzierten Zellen, welche mit dem PKCeps inhibitorischen Peptid EAVSLKPT behandelt wurden und (4) ZFN-generierte (Zink finger nuclease), NGF-induzierte, PKCeps knock-out Zellen, in multiplex Ansätzen quantitativ auf Phosphorylierungen zu vergleichen. Optional werden Zellen mit dem niedermolekularen, PKCeps spezifischen Inhibitor PKCe141 behandelt, welcher im Labor des Antragstellers entwickelt wurde (Patent in Bearbeitung). Für die Realisierung des Projekts werden hochmoderne Methoden der quantitativen Phosphoproteomanalyse verwendet, um den ersten hochauflösenden Schnappschuss von PKCeps Phosphorylierungsmustern zu generieren, welcher die Signalweiterleitung in beschriebenem Zellmodell, direkt nach NGF Stimulierung, offenbart. Auf Grund der Tatsache, dass PKCeps eine sehr wichtige Kinase im ZNS darstellt und ein attraktives Ziel für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten darstellt, zum Beispiel Krebs, Entzündungserkrankungen, Sucht, Schmerz oder Angststörungen, ist die Entdeckung von zusätzlichen therapeutischen Ansatzpunkten essentiell. Durch die Identifikation von PKCeps Substraten und die Aufklärung der involvierten Signalwege könnten neue Ansätze für therapeutische Intervention geschaffen werden und die wichtige Rolle von PKCeps im Nervensystem untermauert werden.