Mitochondriale Teilungsdynamik und Zytoskelett

In den letzten Jahren ist die Forschung zur Teilungs- und Fusionsdynamik von Mitochondrien exponential angewachsen. Große Fortschritte wurden hierbei hinsichtlich der Untersuchung von GTPase-gesteuerten Membranveränderungen erzielt. Weitere Anstrengungen sind erforderlich, um die mitochondriale Dynamik im Kontext von Zellphysiologie und Zelltod zu verstehen. Dadurch wird unsere Aufmerksamkeit notwendigerweise auf die zytoplasmatische Umgebung der Mitochondrien, insbesondere aber das Zytoskelett, gelenkt. Weil das Zytoskelett physisch mit Mitochondrien verbunden ist, kann eine Dynamik seiner Wechselwirkung mit mitochondrialen Membranen angenommen werden. Die Untersuchung solch hypothetischer lokaler Interaktionen erfordert die räumliche Auflösung eines Elektronenmikroskops. Jedoch haben sich alle bisher zur Darstellung von Verbindungen zwischen Zytofilamenten und Mitochondrien angewandten Präparationstechniken als ungeeignet erwiesen, die Dynamik möglicher Interaktionen zu rekonstruieren, da sie auf langsamen, gradientenbehafteten chemischen Fixierungen basieren. Stattdessen sind elektronenmikroskopische "Schnappschüsse" erforderlich, welche ihren Ursprung in einer schnell immobilisierten Feinstruktur des Lebendzustandes haben. Der vorliegende Projektantrag zielt auf Lösungen für systematische elektronenmikroskopische Studien der mitochondrial-zytoskelettären Wechselwirkung, durch die schnelle Fixierungstechniken in diesen Bereich der Forschung Einzug halten sollen. Er verlangt die gekonnte Kombination von Hochdruck-Kryofixierung und Mikrowellenfixierung mit Modifikationen der Basistechniken für Gefriersubstitution und Einbettung von Zellmonolagen. Gegenstand des Projekts ist die Untersuchung einer hypothetischen Rolle von Mikrotubuli bei der teilungsbedingten Abschnürung von Mitochondrien. Zweckorientiert werden mitochondriale Teilungsprozesse in Zellkulturen induziert, welche in Relation zu mitochondrialer Replikation oder dem Tod der Organellen stehen. Durch ihren zahlenmäßigen Anstieg wird die mitochondriale Teilung für systematische licht-und elektronenmikrokopische Studien zugänglich. Letztere schließen die feinstrukturelle Charakterisierung der schnell immobilisierten mitochondrialen Abschnürungen, ihre drei-dimensionale Rekonstruktion und die Lokalisierung molekularer Komponenten des Einschnürungsapparates durch Immunogoldmarkierung ein. Die zu erwartenden strukturellen Belege für eine Beteiligung von Mikrotubuli an mitochondrialen Einschnürungen sollen einen neuen Abschnitt im Studium der mitochondrialen Dynamik eröffnen. Darüber hinaus sollen sie dazu anregen, die Dynamik von Mikrotubuli in einem neuen, unerwarteten Zusammenhang zu studieren.

Wir fanden in der Nierenepithelzelllinie PtK2 neue, organellartige Membranarrays. Dieses unerwartete Ergebnis hatten wir der Auseinandersetzung mit neuen Präparationstechniken für die Elektronenmikroskopie zur Thematik "Mitochondriale Teilungsdynamik und Zytoskelett" zu verdanken. Ausgehend von der Überzeugung dass unserer Beobachtung funktionale Bedeutung zukommt, entschieden wir uns diese neue zelluläre Struktur der Wissenschaft zugänglich zu machen. Unterstützt durch elektronentomographische 3D-Rekonstruktion in Kooperation mit Prof. Neumüller, (Medizinischen Universtät Wien) fanden wir heraus, dass es sich bei unseren Beobachtungen um nichtlaminare Lipidmembranarrays definierter Größe und Architektur handelt. Ihre Strukturen weisen nanoperiodische Ordnungsrinzipien sowohl für die Lipidmembranen als auch für die von ihnen eingeschlossenen proteinösen Strukturen auf. Letztere bestehen aus mehreren proteinhaltigen Tubulen, welche von helixartigen Bändern ummantelt werden. Die grundsätzlichen strukturellen Unterschiede im Vergleich zu bisher beschriebenen zellulären Membransystemen veranlaßten uns zur Namesgebung unter dem Begriff "Tubulohelikale Membranarrays" (TUHMAs) (Reipert et al., Cell Biol Int. 2009, 33:217-223). Indem es uns gelang geeignetete Antikörper für die Markierung von TUHMAs zu finden, eröffneten sich Möglichkeiten für systematische Studien unter Einbeziehung der Immunofluoreszenzmikroskopie. Im Ergebnis dessen kamen wir zu der Erkenntnis, dass es sich bei TUHMAs um einzelorganellartige Strukturen handelt, welche mannigfaltige Kontakte mit anderen Organellen wie dem Golgi-Komplex, dem endoplasmatischen Retikulum und Annulate Lamellae eingehen. Diese Hinweise auf eine außergewöhnlich hohe Dynamik wurden weiter erhärtet, indem wir Vorzugsorientierungen des Membranarrays, entweder senkrecht oder parallel zum Zellkern, identifizierten. Die Beobachtung von Mikrotubulen in Assoziation mit TUHMAs legte ausserdem nahe, dass eine solche Dynamik an zytoskeletale Veränderungen gekoppelt ist. Im letzten Abschnitt unserer Projektarbeit gelang es uns, einen über die intiale strukturelle Beschreibung hinausgehenden Ansatz für die Erforschung der Rolle von TUHMAs zu finden. In dessen Mittelpunkt steht die Möglichkeit des Zusammenwirkens von TUHMAs und Primärzilien im ziliären Zyklus. TUHMAs könnten demzufolge Bedeutung für die medizinische Erforschung von ziliären Erkrankungen (sogenannten Ziliopathien) und das Verständnis der zellulärer Nanomaschinerie unter Einbeziehung möglicher biophysikalischer Eigenschaften erlangen (Reipert et al., PMC Biophysics 2010, 3:13).