Neutrallipide der Hefe

Das vorliegende Projekt beschreibt molekularbiologische, zellbiologische und biochemische Strategien zur Identifizierung von Genen und Genprodukten, die an der Biosynthese und dem Metabolismus von Triacylglycerolen (TAG) und Sterolestern (STE) der Hefe Saccharomyces cerevisiae beteiligt sind. Ziel des Projekts ist das Studium der Depotbildung von Neutrallipiden, und der Mobilisierung diese Lipide aus den sog. Lipid-partikeln unter Fettsäure- und/oder Sterolmangel. Diese Studie wird zum grundsätz-lichen Verständnis des Metabolismus von Neutrallipiden in der Hefe beitragen. Außerdem werden bei diesen Untersuchungen allgemeine Aspekte wie die physiologische Rolle(n) der Lipiddepots sowie deren Bildung und Abbau behandelt. Auf Grund zellbiologischer und biochemischer Ähnlichkeiten wird diese Studie mit dem einzelligen Eukaryonten Hefe auch zum besseren Verständnis dieser Prozesse in mehrzelligen Organismen, z. B. im Menschen, beitragen. Folgende spezielle Aspekte sollen im Rahmen diese Projekts untersucht werden: (i) Identifizierung neuer Gene, die für Enzyme der TAG-Synthese codieren; Charakterisierung und subzelluläre Lokalisierung der Genprodukte; Charakterisierung der Koordination verschiede-ner Wege der TAG-Synthese. (ii) Interaktion von Lipidpartikeln und Endoplasmatischem Reticulum bei der Bildung von STE mit besonderer Berücksichtigung des Transports von Lanosterol zwischen beiden Komparti-menten; Beteiligung des sekretorischen Wegs an der STE-Bildung. (iii) Mobilisierung von TAG und STE aus Lipidpartikeln; Identifizierung, Charakteri-sierung und Lokalisierung von Proteinen (Lipasen, Hydrolasen), die an der TAG- und STE-Mobilisierung beteiligt sind; Identifizierung der entsprechenden Gene; Charakterisierung der koordinierten Regulation des TAG- und STE-Abbaus durch Isoenzyme in verschiedenen Zellkompartimenten. (iv) Zellbiologische Konsequenzen des TAG- und/oder STE-Mangels oder deren Überpro-duktion; phänotypische Analyse von Mutanten mit singulären oder multiplen Defekten in der Bildung und Mobilisierung von TAG und STE in unterschiedlichen Kompartimenten.

Ziel dieses Projekts war die Aufklärung der Biosynthesewege und enzymatischen Reaktionen, die zur Synthese, Depotbildung und Mobilisierung der Neutrallipide, den Triacylglycerolen (TAG) und Sterolestern (STE), beitragen. Die Bäckerhefe wurde als Modellorganismus für diese Studien herangezogen, da generelle Aspekte des Lipidmetabolismus von der Hefe auf höhere Eukaryonten, u.a. den Menschen, übertragen werden können. Die folgenden wichtigen Erkenntnisse konnten in diesem FWF Projekt gewonnen werden: (i) Identifizierung und Charakterisierung neuer Genprodukte der TAG Synthese. Im Zuge unserer Studien konnte die Acyltransferase Dga1p identifiziert werden, welche den Hauptanteil an TAG in Hefe synthetisiert. Besonderes Augenmerk wurde auf die koordinierte Synthese von TAG in verschiedenen Organellen, die Rolle der verschiedenen beteiligten Enzyme und die biochemische Charakterisierung der enzymatischen Reaktionen gelegt. (ii) Funktionelle Charakterisierung der Lipidpartikel, dem Depot von TAG and STE. Diese Studien konzentrierten sich auf die Beteiligung der Lipidpartikel an der Ergosterol-Biosynthese unter besonderer Berücksichtigung des Wechselspiels mit dem Endoplasmatischen Reticulum (ER): Die Oxidosqualene-Synthase Erg7p und die 3- Ketoreductase Erg27p, die während der Sterolsynthese in Wechselwirkung treten, wurden als Komponenten der Lipidpartikel identifiziert. Der Fluss der Sterolintermediate zwischen Lipidpartikeln und ER wurde im Zusammenhang mit Studien an Erg11p untersucht, welches die Reaktion nach Erg7p in der Sterolsynthese katalysiert und im ER lokalisiert ist. Daher ist für den Ablauf der Sterol-Biosynthese Transfer von Sterolintermediaten zwischen Lipidpartikeln und ER erforderlich. (iii) Identifizierung neuer Genprodukte der TAG und STE Mobilisierung aus Lipidpartikeln. In diesem Projekt konnten sechs neue Genprodukte identifiziert und charakterisiert werden, u.z. die drei TAG-Lipasen Tgl3p, Tgl4p und Tgl5p, und die drei STE-Hydrolasen Tgl1p, Yeh1p und Yeh2p. Mit Ausnahme von Yeh2p, welches in der Plasmamembran lokalisiert ist, sind alle anderen Proteine Komponenten der Lipidpartikel. Experimente in vivo und in vitro wurden durchgeführt um diese Enzyme biochemisch und zellbiologisch zu charakterisieren. (iv) Die physiologische Rolle der Neutrallipide. Mit Hilfe einer Quadrupelmutante, die Defekte in allen vier TAG- und STE-Synthasen aufweist, konnte gezeigt werden, dass typische Lipidpartikel-Proteine des Wildtyps in Mikrosomen der Mutante zurückgehalten werden. Dieses Resultat bestätigte die Verwandtschaft der Lipidpartikel mit dem ER.