Die Rolle von HOMER proteinen in Mastzellen

Mastzellen und basophile Zellen spielen bei der allergischen Immunantwort eine entscheidende Rolle. Allergische Reaktionen werden durch Degranulation dieser Zellen ausgelöst, was wiederum durch einen erhöhten, zytosolischen Kalziumspiegel bedingt ist. Im Zuge dieser Reaktion spielen zwei Proteine eine entscheidende Rolle: STIM1 und Orai1, welche in Zusammenspiel den sogenannten CRAC (Calcium release activated calcium) Kanal bilden. Proteine der HOMER Familie können diesen Komplex des speicherabhängigen Kalzium-Einstroms in die Zelle in seiner Funktion und Wirkung unterstützen, wobei aber deren genaue Aufgabe in Mastzellen noch nicht aufgeklärt wurde. Im Zuge dieses Projektes möchte ich die Rolle von HOMER Proteinen (und deren Isoformen) in speicher-abhängigem Kalziumeinstrom untersuchen, wie auch deren Einfluss auf CRAC Ströme und Sekretion in Mastzellen. In Vorexperimenten konnte ich zeigen, dass die HOMER1 Isoformen, HOMER1b und 1c, endogen in RBL-2H3 Zellen exprimiert werden und mit STIM1 kalziumabhängig interagieren. Mittels molekularbiologischer Methoden sollen verschiedene Mutanten von HOMER1 und STIM1 erzeugt und gemeinsam mit biochemischen und biophysikalischen Methoden sollen dadurch die Bindedomänen dieser zwei Proteine genauer studiert werden. In zusätzlichen Experimenten konnte ich zeigen, dass eine Schwächung der HOMER1-STIM1 Assoziation eine Störung des STIM1-Orai1 Komplexes nach sich zieht, was in weiterer Folge speicher-abhängigen Kalziumeinstrom in Blutplättchen modifiziert. Um jene Isoformen von HOMER1 zu identifizieren, welche bei der Wirkung und dem Zusammenspiel des CRAC Kanals in Mastzellen beteiligt sind, werde ich spezifische siRNA Methoden anwenden. Weitere Vorexperimente zeigten, dass durch Unterdrückung der Expression von HOMER1, sowohl die Schaltung des CRAC Kanals direkt betroffen war, als auch Inaktivierung / Reaktivierung in RBL-2H3 Zellen verändert wurde. Um das Zusammenspiel von HOMER Proteinen und dem CRAC Komplex genauer studieren zu können, werde ich biophysikalische Methoden wie Ca2+-imaging, Patch Clamp und konfokale FRET Mikroskopie anwenden. Sowohl RBL als auch HEK293 Zellen werden dafür verwendet werden, um endogene Ströme wie auch CRAC Ströme von überexprimierten HOMER1 Konstrukten zu messen. Des Weiteren möchte ich die Rolle von HOMER1 Proteinen in CRAC-induzierter Granula-Ausschüttung von Mastzellen genauer aufklären. Dafür werde ich sowohl siRNA als auch verschiedene Mutanten von HOMER1 testen. Zusammenfassend werden diese Untersuchungen einen detaillierten Einblick in die Rolle von HOMER Proteinen im STIM1/Orai1-abhängigen Kalziumeinstrom und weiterführend in Sekretion bei allergischen Reaktionen in Mastzellen geben.

Einige häufige Krankheiten in westlichen, hoch-industrialisierten Ländern wie z.B. Diabetes mellitus, Arteriosklerose oder wie in neueren Studien gezeigt weisen auch einige Krebserkrankungen sowie Alzheimer oder Parkinson gemeinsame Charakteristika auf. Es scheint, dass in allen diesen Erkrankungen eine Störung der Kalzium Homeostase bzw. Dynamik vorliegt. Die Studien im vorliegenden Projekt beschäftigten sich deshalb mit molekularen Mechanismen, die Zellen ermöglichen ihre Kalzium Homeostase genau zu kontrollieren. Insbesondere wurde ein Fokus auf den Kalzium-aktivierten Kalzium (CRAC) Kanal gelegt, der in diesen Prozessen eine Schlüsselrolle spielt. Hierbei spielen zwei Proteine eine Schlüsselrolle, nämlich STIM1 und Orai1. Während STIM1 als Kalzium Sensor im ER lokalisiert ist, stellt Orai1 das den CRAC Kanal formende Protein in der Plasmamembran dar. Die Kommunikation beider Proteine sowie die Beteiligung von zusätzlichen Kalzium-Bindeproteinen und einem Lipid als modulierende Zusatz-Komponenten war Gegenstand der im Projekt durchgeführten Untersuchungen.