Topologie der alpha-Untereinheit des maxi-K Kanals

Der Ca2+-aktivierte K+ (maxi-K) Kanal wird durch cytoplasmatisches Ca2+ und Membrandepolarisierung aktiviert und besitzt eine hohe Leitfähigkeit und Selektivität für Kalium. Der maxi-K Kanal soll eine regulatorische Funktion für eine Vielzahl von physiologischen Prozessen besitzen, wie Freisetzung von Neurotransmittern, Kontrolle der Zellerregbarkeit und Regulation der Flüssigkeitssekretion. Durch die Entdeckung von selektiven Toxinen konnte ein besserer Einblick in die molekulare Pharmakologie und physiologische Rolle dieser Kanäle in den verschiedenen Geweben gewonnen werden. Mit Hilfe von [ 125 I]-markiertem Charybdotoxin (ChTX) wurde der maxi-K Kanal aus der glatten Muskulatur der Rindertrachea gereinigt. Der Kanal ist ein Heteromultimer bestehend aus alpha- und beta-Untereintheiten. Die beta-Untereinheit, die keine Homologie zu anderen Proteinen aufweist, moduliert die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften der alpha-Untereinheit. Die Membran- Topologie der beta-Untereinheit besitzt einen glycosylierten extrazellulären-Bereich zwischen den zwei transmembraneren Domänen und einem im Cytoplasma lokalisierten N-terminus und C-terminus. Für die Membran-Topologie der alpha-Untereinheit existieren derzeit mehrere Modelle. Die ursprünglich vorgeschlagene Sekundärstruktur von 10 transmembraneren Domänen (6 N-terminale und 4 C-terminale) wird in Frage gestellt, wobei eine Sekundärstruktur mit nur 7 N-terminalen Domänen favorisiert wird. Durch Kombination verschiedener Methoden soll die Membran-Topologie der alpha-Untereinheit aufgeklärt werden. Die Herstellung einer Cystein- freien alpha-Mutante ist eine notwendige Voraussetzung. Anschließend soll jeweils ein Cystein in extra- und intrazelluläre Bereiche einer Cystein-freien alpha-Mutante eingefügt werden. Dieses reaktive Cystein kann mit sulfhydrylselektiven Reagenzien reagieren. Die Verwendung von membranpemeablen und nicht membranpemeablen Reagenzien gibt Aufschluß über die intrazelluläre bzw. extrazelluläre Lokalisation des Cysteins. Zusätzlich soll die Herstellung von alpha-Untereinheiten mit N-Glycosylierungsstellen in extra- und intrazellulären Bereichen zur Aufklärung der Topologie der alpha-Untereinheit beitragen. Glycosylierte Proteine wandern mit einem höheren apparenten Molekulargewicht in SDS-PAGE. Durch Degylcosylierung mit N- Glycosidase F kann die Existenz von N-gebundenen Glycanketten nachgewiesen werden.