Chemische Synthese modifizierter Twister-Ribozyme

Erst kürzlich wurde eine neue Klasse von selbstschneidenden Ribozymen entdeckt (Roth, A. et al. Nat. Chem. Biol. 2014, 10, 56), die allgemein als `Twister-Ribozyme bezeichnet werden. UnsereVorarbeitenführten in Kooperationmit Dinshaw Patel zur Kristallstrukturaufklärung eines Twister-Ribozyms (env22) mit 2.9 Å Auflösung (Ren, A., Kosutic, M., Rajashankar, K. R., Frener, M., Santner, T., Westhof, E., Micura*, R., Patel*, D. J. Nat. Commun. 2014, doi: 10.1038/ncomms6534). Überraschender Weise zeigten sich in der Architektur der katalytischen Tasche deutliche Unterschiede zu zwei soeben unabhängig erschienenen Kristallstrukturen. Die nahezu ideale, lineare Anordnung der angreifenden 2- OH Gruppe mit der zu lösenden PO5 Bindung unserer Struktur steht im Kontrast mit den orthogonalen Anordnungen in der 2.3 Å-Struktur des Oryza sativa Ribozyms (Liu, Y. et al Nat. Chem. Biol. 2014, 10, 739) und in der 4.1 Å-Struktur des env Ribozyms (Eiler, D. et al. PNAS 2014, 111, 13028). Ein weiterer beunruhigender Aspekt ist die unterschiedliche Anordnung von Nucleosiden an der Phosphatschnittstelle, und die Anwesenheit/Abwesenheit von divalenten Kationen an der Phosphatschnittstelle. Andererseits unterstreichen alle drei Studien die Schlüsselrolle eines konservierten Guanosins. Das hier vorgeschlagene Projekt fokusiert sich darauf, die gegensätzlichen strukturellen Gegebenheiten von Twister-Ribozymen und die daraus resultierenden mechanistischen Szenarien aufzulösen. Dies soll durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Methoden erreicht werden, die von atomarer Mutagenese und Nucleosid-Mutagenese, über Ensemble- und Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie, bis hin zur NMR-Spektroskopie reichen, und auf maßgeschneiderten, chemisch modifizierten RNAs basieren. Das übergreifende Ziel des Projekts besteht in einem umfassenden Verständnis des chemischen Mechanismus von Twister-Ribozymen. Dieses Ziel soll durch einen systematischen, Hypothesen-gesteuerten Zugang erlangt werden, der die Stärken der organischen Synthese (i.e. Synthese modifizierter Nucleoside; Synthese positionsspezifisch gelabelter RNA über Festphase), der bioorganischen Chemie und chemischen Biologie (i.e. zielgerichtete atomare Mutagenese und Nucleosid-Mutagenese), und der Biophysik (2- Aminopurin-Fluoreszenz,Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer(smFRET) und NMR Spektroskopie zur Aufklärung der funktionellen Dynamik von Twister-Ribozymen in vitro,basierendaufneuen, photostabilenFluorophorenbzw.spezifischen Isotopenmarkierungen) zusammen führt. Folglich werden wir ein bisher unerreichtes Maß an Verständnis der chemischen Konzepte, welche Twister-Ribozyme für die Phosphordiesterspaltung nutzen, erzielen, und so den Weg für ihre breite biotechnologische Anwendung ebnen.

Das wissenschaftliche Ziel des Projekts war es, ein gründliches Verständnis des chemischen Mechanismus von Twister-Ribozymen zu erhalten. Dieses Ziel wurde durch einen multidisziplinären, systemischen Ansatz erreicht, der die folgenden Fachgebiete einbezieht: Organische Synthesechemie und Synthesemethodik (d.h. die Synthese modifizierter Nukleoside; die Synthese ortsspezifisch markierter RNA durch Festphasensynthese), Bioorganische Chemie und Chemische Biologie (d.h. die gezielte atomspezifische Mutagenese und Nukleosidmutagenese), und Biophysik (d.h. 2-Aminopurin-Fluoreszenz-, Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer(smFRET)-, und NMR-Studien zur Aufklärung der strukturellen Dynamik des Ribozyms in vitro, basierend auf markierten RNAs mit neuen photostabilen Fluorophoren bzw. Isotopenmustern). Die folgenden Zielsetzungen wurden erreicht: Ziel 1 - Identifizierung der Nukleoside und Strukturelemente, die für die Twister-Ribozymspaltung kritisch sind. Ziel 2 - Entwicklung effizienter Wege für Deazanukleosid-Phosphoramidite, um atomare Mutagenese-Experimente an Twister und anderen Ribozymen zu ermöglichen. Ziel 3 - Entwicklung einer chemischen 'Probing'-Methode zur Aufklärung der Faltung kleiner Ribozyme. Ziel 4 - Aufdeckung der Twister-Ribozym-Faltung mittels Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie. Ziel 5 - Gründlicher Vergleich des Twister-Ribozymes mit anderen kürzlich entdeckten kleinen Ribozymen.