Inhibitoren der IL-8/Glykosaminoglykan Interaktion

Glycosaminoglykane (GAGs), wie z.B. Heparansulfat (HS), sind natürliche Ko-Rezeptoren von Chemokinen in vivo, durch welche die Etablierung von chemotaktischen Gradienten ermöglicht wird. In einem vorangegangenem Projekt konnten wir zeigen, daß ein HS Oktasaccharid die optimale Bindungslänge für das proinflammatorische Chemokin Interleukin-8 (IL-8) darstellt, welches an GAGs nur dann mit hoher Affinität bindet, wenn es als Monomer vorliegt. Zusätzlich konnte ein zuverlässiges 3-D Modell eines IL-8/GAG Komplexes berechnet werden. Basierend auf diesen Resultaten wollen wir im vorliegenden Projekt mithilfe eines kombinierten Ansatzes aus Molekularbiologie und synthetischer Chemie Inhibitoren der IL-8/GAG Interaktion entwickeln, sowie zusätzlich robuste, in vitro und in situ, Testsysteme zur Untersuchung der biologischen Aktivität dieser anti- inflammatorischen Verbindungen etablieren. Zwei Arten von Inhibitoren sollen im Verlauf dieses Projekts hergestellt werden: (i) rekombinante, genetically engineered IL-8 Mutanten und (ii) synthetische GAG Oligosaccharide. Die IL-8 Mutanten sollen, im Vergleich zum Wildtyp, eine höherere Affinität bzgl. GAGs aber keine Interaktion mehr mit dem Neutrophil-Rezeptor aufweisen. Rekombinante Medikamente dieser Art würden wtIL-8 von seinem Ko-Rezeptor verdrängen, aber nicht mehr in der Lage sein, Neutrophile aus dem Blut zum Entzündungsherd zu rekrutieren. Andererseits sollen die im Rahmen dieses Projekts synthetisierten, IL-8- spezifischen GAG Oligosaccharide mit den natürlichen GAG Liganden um die IL-8 Bindungsstelle kompetieren, dabei die Ko-Rezeptorbindung antagonisieren und daher eine Immobilisierung von IL-8 an der Endothelwand verhindern. Die Synthese von GAG Oligosacchariden stellt jedoch eine grosse präparative Herausforderung dar, was nicht zuletzt in den wenigen bislang publizierten derartigen Substanzen mit biologischer Aktivität zum Ausdruck kommt. Sowohl rekombinante Proteine als auch Oligosaccharide sollen biophysikalisch bzgl. ihrer Affinität zu natürlichen GAG Liganden bzw. zu wtIL-8 in vitro charakterisiert werden. Zusätzlich werden wir ein zelluläres Testsystem entwickeln, um die IC50 Werte der IL-8 Mutanten als auch der GAG Oligosaccharide zu bestimmen. Dieser Assayberuht auf von uns stabil mit dem IL-8 Ko-Rezeptor transfektierten Zellen, mit deren Hilfe die Verdrängung von fluoreszenz-markiertem IL-8 durch die Inhibitoren quantifiziert werden kann. Wir hoffen, am Ende des Projekts (eine) Leitsubstanz(en) präsentieren zu können, deren biologische Aktivität in vivo im Rahmen einer Industrie-Kooperation anhand eines Maus-Modells weiter getestet werden soll(en). Die Exploration neuer antiinflammatorischer Ansätze durch die Inhibition der IL-8/GAG Interaktion wird dahr zu neuen Einblicken in die Struktur/Funktions Wechselwirkung führen, auf der diese biologisch wichtige Interaktion basiert.